氧化应激状态下CDK1对caspase-2及高尔基体形态的影响

【摘要】研究背景与目的：氧化应激(OxidativeStress,OS)被认为是组织细胞衰老的重要因素,也被证实是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的重要发病机制。氧化应激在神经退行性病变中同样发挥着重要的作用。对氧化应激的相关研究对解释这些疾病的生理及病理过程,改善治疗方法具有重要的意义。近年来对氧化应激的研究发现其可能是一个多细胞器参与的复杂的生化过程。在这个多细胞器参与的生化过程中高尔基体发挥着重要的作用。本课题组在国际上率先提出了高尔基体应激(Golgiapparatusstress,GAstress)概念,为系统地研究氧化应激提供了新的思路和方向。在细胞的有丝分裂和减数分裂过程中,高尔基体存在生理性裂解,保证细胞分裂的正常进行。在氧化应激及其介导的细胞凋亡中同样存在高尔基体裂解,并且许多调控细胞有丝分裂或减数分裂中高尔基体裂解的相关蛋白同样参与氧化应激过程。周期素依赖蛋白是调控细胞有丝分裂和减数分裂的重要蛋白,而其中的CDK1被发现在细胞凋亡过程中同样发挥作用。氧化应激中,caspase-2参与高尔基体裂解过程,并发挥重要作用。CDK1在氧化应激介导的细胞凋亡过程中是否同样发挥作用?是否参与高尔基体形态变化?这个过程是否与caspase-2有关?本研究将以小鼠神经瘤细胞为研究对象,通过抑制CDK1活性,观察氧化应激状态下caspase-2活性变化、高尔基体形态变化及细胞凋亡情况,对以上问题进行初步的探讨。方法：1使用H2O2建立N2a细胞氧化应激模型。流式细胞术检测细胞增殖指数,观察不同H2O2浓度和处理时间对细胞的伤害作用,确定最佳H2O2浓度和处理时间。2将实验分为正常对照组、H2O2处理组和CDK1抑制组。3使用流式细胞术检测各实验组细胞凋亡率,免疫荧光观察细胞核形态变化,研究氧化应激中各实验组细胞凋亡情况。4使用Westernblot和分光光度法检测caspase-2的表达和活性。5使用免疫荧光观察高尔基体形态变化。结果：1流式细胞术检测细胞增殖指数：相同作用时间,H202作用浓度越大N2a细胞增殖指数越小；相同作用浓度时,H202作用时间越长N2a细胞增殖指数越小。确定H202最佳作用浓度为80μM,作用时间为12h。2流式细胞术检测N2a细胞凋亡率：CDK1抑制组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均高于正常对照组而低于H2O2处理组,且各组之间凋亡率有显著差异(P<0.05)。3Hoechst染色观察细胞核：在正常对照组中,细胞核大小较均匀,未见细胞核形态明显异常,未见细胞核浓缩和碎裂；H2O2处理组中,细胞核大小不一,可观察到细胞核碎裂和凋亡小体；CDK1抑制组细胞核大小较均匀,偶可见细胞核碎裂,但不明显。4Westernblot结果：caspase-2表达从多到少顺序为H2O2处理组>CDK1抑制组>正常对照组,各组间存在显著差异(P<0.05)。5分光光度法测caspase-2活性：caspase-2酶活力单位,从大到小依次为H2O2处理组>CDK1抑制组>正常对照组,各组间存在显著差异(P<0.05)。6免疫荧光观察高尔基体形态：在正常对照组中,高尔基体较完整,围绕在细胞核周围,高尔基体无明显弥散现象；H2O2处理组高尔基体弥散较明显,出现细胞核区被高尔基体覆盖现象,未出现典型高尔基体裂解现象；CDK1抑制组出现部分高尔基体弥散现象,细胞核被覆盖较少,也没有出现典型的高尔基体裂解现象。结论：1CDK1参与了氧化应激介导的N2a细胞损伤。2在氧化应激诱导的N2a细胞凋亡过程中CDK1对caspase-2活化起到推动作用,并导致高尔基体形态变化。
【作者】郭滏林；
【导师】胡治平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】氧化应激；高尔基体；周期素依赖激酶；细胞凋亡蛋白；

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